低分子瓜尔胶压裂液体系在国外己经开始成为油田增产措施的一种方法，并且取 得很好的经济效益，但是在国内有关报道还比较少，值得我们去探索。通过上述大量 的文献调研可知，酶降解瓜尔胶是一类比较复杂的反应，受各种因素及条件的制约， 这为我们的进一步研究奠定了坚实的理论基础。本章研究的重点是瓜尔胶降解的反应 条件及影响因素。
2.2酶的基本特性酶是一种非常重要的物质P3-25】，它几乎参与了所有的生命活动、生命过程，而且 在生产实践中同样起着十分重要的作用，渗入了人们生活的各个领域。酶的发现和应 用可追溯到千百年前，但酶的本质直到近几十年才被逐渐认识。酶实际上是一种催化 剂，而且催化效率远比一般催化剂高，酶催化反应的反应速度约为一般催化剂参与反 应的反应速度的10ia?1〇16倍，酶反应只改变反应速度，但不改变反应性质、反应方 向和反应平衡点，而且本身在反应后也不发生变化的外在因素。我们在本次研究中之 所以会选用酶，一个很重要的因素是它的作用专一性，是指酶通常只能催化一种或一 类反应，作用一种或一类极为相似的物质。这就是酶的高度催化特异性，在酶学研究 中对其专一性做了如下分类：(1)光学专一性（optical specificity):指一种酶只能催化一对镜像异构体中 的一个，而对另一种异构体不起作用。
⑵几何专一性（geometrical specificity):对于含有顺、反式结构的物质， 酶只作用于其中的一种。
以上两种的专一性因与底物的立体化学关系密切，所以又统称为立体化学专一 性。
⑶键的专一性（bond specificity):酶只对某类的化学键起作用。
⑷基团专一性（group specificity):具有这种专一性的酶，不但对底物的化 学键具有专一性，而且对键一侧的基团也有专一性的要求。这种专一性有时又称为相 对专一性（relative specificity)。
(5)绝对专一性（absolute specificity):这类酶要求底物含有的化学键及键两 侧的基团都必须严格符合酶的要求，否则酶无法起到催化作用。
后三种的专一性因不涉及立体化学的因素，可统称为非立体化学专一性。
本次研究中所选用的6 _甘露聚糖酶与瓜尔胶的结构就非常相似。
酶的化学本质实际上是蛋白质，其根据有：⑴酶是髙分子胶体物质，而且是两性电解质，在电场中酶能像其他蛋白质一样 泳动，酶活性-pH曲线和两性离子的解离曲线相似；⑵导致蛋白质变性的因素，如酸、碱、热、紫外线、表面活性剂、重金属盐以 及其它蛋白质变性剂，也往往能使酶失效：⑶酶通常都能被蛋白水解酶水解而丧失活性；⑷对所有已经高度纯化、而且达到均一程度的酶进行组成分析，都表明：它们 或者是单纯的蛋白质，或者是蛋白质与小分子物质构成的络合物；(5)根据核酸酶的一级结构，人们已从氨基酸开始人工合成了具有相同催化活性 的蛋白质产物，只有了解酶的这些性质，在用酶作为降解的反应物的过程中才能很好 的了解反应过程、反应因素等。
酶的分析方法也是很关键的，通常是通过酶反应速度的测定以达到临床检验和化 学分析目的的一种分析。包括两种类型：一是以酶为分析对象的分析，成为活力测定： 二是以酶为分析工具的分析，有称为酶法分析。
酶的种类很多，根据酶的催化作用类型可以分为六大类：氧化还原酶类、转移酶 类、水解酶类、解（和）酶类、异构酶类、合成酶类。甘露聚糖酶应属于内切水 解酶类。这类酶在体内担负降解任务，其中许多酶集中于溶酶体。它们是目前应用最 广的一类酶。一般不需要辅酶物质，但无机离子对某些水解酶的活性有一定影响。习 惯命名时常采用“底物+酶”的形式，即省去其中的“作用类型”，例如，淀粉酶、脂 肪酶等。为了区别起见，有时要加上酶的来源，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。甘露 聚糖酶就是用来专门水解甘露聚糖的，所以称为e-甘露聚糖酶。根据水解键的类 型，又可以分为九个亚类，这里就不再一一列举了，其中P-甘露聚糖酶应该属于糖 甙类，作用底物主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚 糖。P -甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要与a -半乳糖残基和葡萄糖残基在主链 中的位置、含量、酯酰化的程度有关，当然底物本身的物理状态也会影响酶对底物的 作用，比如结晶状态的甘露聚糖就不易被降解。另外，不同来源的甘露聚糖酶对 底物的要求也不一。
有关酶的基础知识的了解对于本次研究中酶的选用、反应条件以及影响因素的确 定都是至关重要的，它是涉及本次研究成败的重要因素。
2.3以水为介质，酶降解瓜尔胶的反应条件和影响因素研究影响酶降解瓜尔胶的因素是多方面的，例如瓜尔胶溶液浓度、温度、介质、产物 浓度、酸碱性、反应时间及紫外线等，甚至搅拌速度的不同都要影响降解的速度。下 面主要研究的是温度、pH值、酶用量对降解反应的影响。
2.3.1温度对酶反应的影响无论化学反应还是酶反应都需要合适的反应温度，只有在最佳温度下反应才能达 到最佳的反应效果。
2.3.1.1酶反应的“最适温度”
温度即可以改变酶反应的反应速度，也能导致酶蛋白变性失效，由于任何一种反 应都是在一定温度条件下进行的，温度的这两种效应都会发生作用。通常所说的“最 适温度”，就是这两种效应的综合结果。
如果让酶反应在不同温度条件下进行，然后，再将测得的反应速度相对温度作图， 一般可得到一条钟罩形的曲线，如图2.1。
P-甘露聚糖酶的也不例外，反应速度受温度影响显着。把瓜尔胶溶液置于不同的温度下进行降解反应，然后用粘度的降低值对温度作图。其具体做法如下：(1)配制pH为9瓜尔胶溶液；(2)取溶液200ml,放入20°C水浴中，当液体温度均匀并达到2(TC时，用旋转粘 度计侧量溶液粘度q,为309mPa. s;(3)加入0.05%的酶，搅拌均匀，降解时间为lOmin;(4)用旋转粘度计测试反应后的粘度n2为123mPa. s;(5)计算前后两次粘度差值A ri=rirn2;(6)然后再分别计算温度为3(TC、4(TC、44°C、5(TC、6(TC、7(TC、8(TC时反应 前后的粘度差，方法同上；(7)将所得数据列于下表2.1;表2.1温度对反应的影响温度（1C)1017.52030404550607080Hi (mPa. s)330313. 5309294285288270258246228Ai (mPa. s)247.5199.5189123847570.590219228An82.5114120171201213199.5168270(8)作图2.1。它表明，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大， 但超过一定温度后，反应速度反而迅速下降。这通常被认为是有两个阶段的影响：首 先，在较低的温度下，温度升高加速了酶的活力，同时也使分子跃过活化能阀的几率 提高，从而提高了反应的速度；随着温度升高到了一定的程度后，酶蛋白的变性影响了酶反应的速度，使降解速度逐渐下 降。这里值得注意的是，温度升高同 时具有两方面的作用：在反应的最初 阶段，酶蛋白随温度的变性不明显， 此时酶促反应主要体现了温度体反 应速度的作用；由于温度促使酶变性是随着时间累加的，当时间逐渐延长后，酶蛋白的变性就明显了，最后可能使酶蛋白 变性抵消了温度升高所提高的反应速度，最后酶就失去了活性。在图2. 1中曲线发生 转折时的温度就称为酶反应的“最适温度”。产生钟罩形的原因就是由于一方面温度 加速了酶反应的进行，另一方面温度加速了酶蛋白变性。
温度的这种综合影响，也就是说，“最适温度”与时间有密切关系，不同的反应 时间测得的最适温度往往不同。这是由于温度促使酶蛋白变性是随时间而累加的。故 而在不同反应时间内测得的“最适温度”也就不同，且随反应时间延长而降低。
2.3.1.2温度对酶反应速度的影响可根据Eyring等的绝对反应速度理论，也称为过渡态理论来进行讨论，这种理 论认为，在反应系统中，并不是所有的分子都能进行反应，他们需要获得一定的能量 转入瞬时的活化状态，即成为活化分子以后才能反应成产物，这种从“基态”到“活 化态”所需要的能量称为“活化能”（Ea)。
要加速反应有两种办法：①增加活化分子的数目；②降低反应的活化能。分子一 般通过相互碰撞而传递能量，升高温度一方面能增加分子的动能，另一方面也能增加 分子间的碰撞频率，因此，温度升高可加速反应。催化剂所以能加速反应是因为他们 能通过形成活化能较低的中间络合物，降低反应总的活化能。这里的反应也是这样。 图2. 2是以反应A + BoC + D为例，图示基态、活化态反应物的能量状况以及催化 剂存在条件下的能量变化。如果酶对热稳定，那末，反映在温度升高时，将同时受到 温度增加反应物分子的动能和降低反应活化能的双重影响。但是值得提到的是，对于 催化剂促进的反应来说，它们的温度系数一般小于非催化反应，说明催化剂降低活化 能可能是加速反应更重要的因素。
图2. 2酶促与非酶促反应的自由能变化 催化剂通过形成中间络合物降低活化能（A)
酶促反应（B)
2.3.1.3酶的热稳定性化学反应（包括催化反应在内）的活化能8368_167360 J/mol左右，大多为 50208-104600 J/mol ;而蛋白质变性的活化能则高得多，通常达167360-418400 J/itiol，这主要是由于变性伴随熵值显着升高的缘故，正因为如此，酶在溶液中很容(A)
易随温度升高而急剧失效，失效的温度 系数从10到几百。
为测定P ~甘露聚糖酶的热稳定范 围，可先将酶迅速升高至所要检测的温 度，然后在不同的时间间隔取样，并在 酶稳定的温度条件下测定残存的活力。
如图2. 3所示，甘露聚糖酶在5CTC左 右开始失效，80°C时就完全没有活力了。 2.3_2 pH对0 -甘露聚糖酶反应的影响同理，酶反应也需要在一定的pH条件下进行，酸、碱即能影响酶的稳定性，也 能直接影响酶的催化活性。在一定PH值下酶表现最大活力，高于或低于此PH值，活 力均下降。酶表现出最大活力的pH值称为酶的“最适pH”。
2,3.2."-甘露聚糖酶稳定性的影响酶都有一定的酸、碱稳定范围，超出这个范围后，酶就会变性失效?
为了了解甘露聚糖酶在酸、碱中的稳定性情况，通常都要制备一条酶稳定性 -pH曲线。方法是先将酶溶液分成若干份，分别置于不同的pH溶液中保温一定时间， 然后再调整至某一共同所示。从图2.4中可以了解到酶的稳定状况，P-甘露聚糖酶 在pH>8时稳定性明显下降。
在制备酶的稳定性-pH曲线时，应该 注意介质的组成成分和温度条件，因为 它们也可能和pH同时对酶的稳定性产生 影响。另外，酸、碱对酶的破坏作用是 随时间累加的，因此，还必须注意在相 应条件下的保温条件。
2.3.2.2pH对酶活力的影响典型的酶活力-pH曲线犹如钟罩形，图2.5是甘露聚糖酶的活力-pH曲线，它 和两性电解质在不同pH的解离曲线很近似。因此，最初认为pH对酶活力影响的根本 原因可能是由于酸、碱影响了酶的解离状态。但是经大量的研究表明，而是因为酸、 碱改变了酶的活性中心或与之有关的基 团的解离状态=也就是说，酶要表现活性，它的活性部位的有关基团都必须选取一 定的解离状态，其中任何一种基团的解离 状态发生了变化就将使酶从活性状态转 入无活性状态；反之亦然；至于活性部位 以外的其它基团则无关紧要。
由于本研究使用的甘露聚糖酶是一种粉末，溶于水不能形成均相溶液，而且 酶溶液的效果也不是很好，与直接用酶粉末来降解相比，反应效果比较差。因此我们 采取直接将酶粉末加入到瓜尔胶基液中的方法。其具体做法如下：(1)将配制好的瓜尔胶溶液分成9等份，然后调整pH值，使之分别达到4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0;(2)将调好酸碱性的瓜尔胶溶液放入45°C水浴中，使液体温度均匀，并达到45 °C,用旋转粘度计测基液45T：时的粘度为282mPa. s;(3)分别加入0.05%的酶，搅拌均匀，降解的时间为l〇min;(4)然后用旋转粘度计分别测试反应后的粘度；(5)测试数据如下表2. 2:表2. 2 pH值对反应的影响pH值3.04.05.06,07.08.09.010.011.0A n (mPa. s)062.25153171242.520419413902,3.3酶用量及水解时间的研究降解的程度并不是越大越好，所谓低分子瓜尔胶指的是控制降解的程度，使降解 后的液体仍可以满足压裂液的需求，所以降解后的液体必须具有一定的粘度，而不能 降解成单糖或寡糖，单糖或寡糖很难再交联成冻胶。综合考虑多种因素，确定酶的用 量和水解的时间。通过对反应条件的研究，以后降解条件均为：1%瓜尔胶基液、温度 为45=C、pH为7.0。其具体做法如下：(1)取调好酸碱度（7.0)的基液200ml，放入451：水浴中，使液体温度均匀，并 达到45X：，用旋转粘度计测量基液45°C时的粘度n,为288mPa. s;(2)按照0.01%的酶用量加入到基液中，分别间隔不同的时间段测量粘度，见表2.3；(3) 然后再分别把酶的用量提高到0.02%、0,03%、0.04%及0.05%,实验方法同 上；(4)利用实验数据作图2. 6。
表2. 3不同酶用量及不同反应时间对液体的影响时间（min)0.01%0. 02%0.03%0.04%0.05%0288288288288288516Z1179072631012673.552,540.531.51594,551392419.52076.53925.5181530572416.512940421810.5965030127.5667019.5964, 54.50 1〇 20304050607080时间(min>图2.6不同酶用量及不同时间对液体粘度的影响2.3.4正交实验法通过以上实验可以大致了解各种条件对降解反应的影响，下面再用正交实验法来 验证所做工作的可靠性。决定反应的条件有温度、酸碱度、瓜尔胶基液的浓度、酶的 浓度、反应时间等，如果把每一种因素都全面实验，而且每一个因素只取四个水平， 就需要4*4*4*4*4=1024次实验，这显然是不现实的。因此希望只选做其中的一部分 实验，就能相当好的反应全面搭配可能出现的各种情况，以便从中选出较好的实验方 案。这里我们选择正交实验设计，就是利用一套现成的规格化的表——正交表来安排多因素实验，并对实验结果进行统计分析，找出较优实验方案的一种科学方法[29]。具 体来说，它能明确回答下面几个问题：（1)因素的主次，几个因素对考察指标的影响 的大小顺序。（2)因素与指标的关系，即各个因素各水平不同时，指标是如何变化的。 (3)什么是较好的生产条件或工艺条件。（4)进一步实验的方向。
在这里我们引用一张常用的JR交表L9(34)，其中L:正交表的符号；9:正交表 安排的实验次数，即正交表行数；4:正交表列数（最多可安排因素的个数)；3:每 个因素的水平数。见表2.4。
表2.4正交表1^(34)
、\^号 实验号1234111112122231333421235223162312731328321393321容易看出，表2.4有如下两个性质：①表中任一列所含各种水平的个数都相同。如L,(34)中各列皆三个“1”、三个“2”、 三个“3”。称这一性质为整齐可比性。
②表中任两列所有各种可能的数对出现的次数都相同。表中1、2、3三个数字的 可能数对为(1， 1)，（1， 2)，（1， 3)
(2， 1)，（2, 2)，（2, 3)
(3， 1)，（3， 2),(3, 3)
九种，而表中任何两列，这九种数对皆出现一次。称这一性质为均衡搭配性^我们看到，用」下交表安排实验将大大减少实验次数。而且由正交表的性质可知部 分实验中所得的最优条件可以代表全面实验。
下面完全按照各号实验条件进行实验。瓜尔胶基液的浓度依然是1%，粘度（25 ?C) =291tnPa.S。实验结果一列中记录的数据是指严格按照各自的实验条件降解后得 到的粘度（25°C)去减降解前的粘度得到。这里我们利用极差分析法分析实验数据。 实验情况见表2.5。
表2. 5极差分析数据表实验号T(V)t(min)pHC(酶）
(质量浓度）A Tf(mPa. s)
130105.00,00527230307.00.01189330509.00.02195450107,00.02225550309.00.005118.5650505.00.0196760109.00.01130.5860305,00.02102960507.00.005205.5I,411382.5225351IIj439.5409.5619.5415,5Uh438496.5444522氏28.5114394.5171由表3.5的I』，IUIII』，艮的含义可知，h表示在因素A,水平下的三次实验的数 据和，在这三次实验中，其余B、C、D三个因素的1、2、3水平皆各出现一次，因 此数据和I,反映了三次A,水平的影响，和B、C、D每个因素1、2、3水平各一次的 影响。同样，数据和IL反映了三次A2水平的影响及B、C、D每个因素的三个水平各 一次的影响；数据和III,反映了三次A3水平的影响及B、C、D每个因素三个水平各一 次的影响。因此，可以认为B、C、D三个因素的对h、11卜III!的影响是大体上相 同的，而h、Ih、1山之间的差异可以看作是由于A取了三个不同的水平而造成的。 于是1卜II,、Ilh的数值可以大体上反映因素A的1、2、3水平对降解影响的情况， R反映了因素A选取的水平变动对降解程度影响的大小。同理其他的各项意思相同。
根据极差Rj这一行的数据可知，第三列和第四列较大，第一列最小。这表明酸 碱性和酶的浓度变动时，对反应的影响最大，温度对反应的影响较小。因此根据极差 的大小顺序排出条件的主次：pH值最重要，其次是酶的用量及反应时间，温度最后。 因此生产时要特别控制反应pH值，其它的要根据经济和方便的生产条件而定。需要 指出的是，把每个因素的好水平结合起来而得到的较好生产条件往往不包括在已做过 的9次实验中，如5(TC、50min、pH=7.0、酶浓度为0,02%就不在这次实验中。这时 若以选出的较好生产条件作验证性实验一般都回比所做过的9次实验的效果好。这是 因为使用正交表安排的9个实验室所有搭配中的典型代表，由9个代表能把较好的实 验条件挑出来，这正是正交实验的优点。但是我们这里所要达到的要求并不是把瓜尔 胶降解到单分子，需要中间中止反应，因此具体的实验条件必须和经济和具体情况挂 钩。
下面看一下各因素的水平变化时的情况，可以通过因素-指标图来刻画。对每个 因素，以指标为纵坐标，因素的水平为横坐标作因素-指标图，并连成折线，如图2,7?
从图2.7可以看出，反应温度从水平3(TC?601C时，上升趋势不明显，也就是说 温度在这个温度范围内对反应的影响不是很大；反应时间从1〇?50min时，降解程度 增大，但是要根据实际需要来确定反应的时间；同理，pH=7时对降解最有利；至于 酶的用量肯定是浓度大了最好，但是要考虑到经济的问题，也不要求酶的浓度越大越 好。
305060103050573 0.0010.010.02反应温度反应时间Ph值赚度图2. 7因素-指标图2.4本章小节顾名思义，低分子瓜尔胶的分子量应该相对较低。那么如何降低瓜尔胶原粉的分 子量，本章解决的正是这个问题。首先确定了选用酶作为降解反应物，根据瓜尔胶的 分子性质|认为甘露聚糖酶是瓜尔胶的特异性酶，降解的产物可以满足压裂施工 的要求。
本章解决的第二个重要问题就是fi -甘露聚糖酶反应的控制因素及反应条件。主 要从反应温度、反应酸碱性、底物浓度、e-甘露聚糖酶浓度、反应时间等方面研究 了 0 -甘露聚糖酶降解瓜尔胶的条件。实验结果表明，e -甘露聚糖酶反应的‘‘最适温 度”为45X：、“最适pH”为7、基液浓度初步定为1%、e-甘露聚糖酶的浓度初步定 为0.02%,至于反应时间可以根据需要而定。最后使用正交实验法验证了实验结果， 从图3.7可以看出，对降解反应影响较大的因素有反应时间、pH值、e-甘露聚糖酶。 从这些实验可以得出，对任何反应都要综合考虑各种因素对反应的影响。