由于半乳甘露低聚糖的最适温度为501C,故选择 50T作为最适酶解温度，以0.3%瓜尔胶为底物，以底 物的酶解率为指标，以加酶量（U • g^kpH值和酶解 时间为影响因素，进行L1S(43)3因素4水平正交实 验，通过极差分析和实验结果确定最佳酶解条件。
1.4半乳甘露低聚糖产率的测定
在最佳反应条件下进行酶解反应，反应完毕在沸 水中将酶灭活，酶解液过滤，移至超滤装置中，在0.2 MPa的压力下，使用截留分子量为1000 Da的超滤膜 截取分子量<1000 Da的寡糖。收集超滤透过液，浓 缩，冷冻，干燥，即得GMOS干粉，准确称取其质量。 按式(2)计算GMOS的产率。
产率祕 1.S酶解产物的表征
用时间飞行质谱(MALDI-TOF)鉴定酶解产物的 分子量和聚合度。质谱仪的氮激光器波长337 rnn，采 用延时引出（Delayed extraction)和反射（Ref lection ) 的工作方式，加速电压19. 5 kV，反射电压20 kV，延 时引出电压14. 5〜16.5 kV,延时时间50〜200 ns，正 离子检测。.
用核磁共振碳谱(13CNMR)对酶解产物进行结构 表征。并用高效液相色谱法（HPLC)检测酶解产物中 各组分的含量，色谱条件：色谱柱NH2 Column U16 mmX250 mm),柱温 30X：,流速 1 mL • min一】，进样 量为20 pL,流动相乙腈••水=75 : 25。根据GMOS 保留时间定性，色谱峰面积归一化法定量。
2结果与讨论
2.1正交实验结果与分析
按照L1S(43)设计正交实验方案，测定了不同条件 下瓜尔胶的酶解率，结果见表1。
从表1的极差分析可以看出，各因素对瓜尔胶酶 解率的影响大小依次为:pH值>加酶量>酶解时间。 最佳酶解条件为：pH值7.0、酶解时间10 h、加酶量 40 U . g-1。
2.2半乳甘露低聚糖的产率测定
在上述最佳酶解条件下，对1000 mL 0. 3%瓜尔 胶液进行酶解反应，酶解液通过截留分子量1000 Da 的超滤膜，透过液经浓缩，冻干，得到GMOS干粉
1.27 g。按式(2)计算，GMOS的产率为42. 3%»
2.3半乳甘露低聚糖的结构表征
2.3.1 MALDI-TOF 分析
片甘露聚糖酶酶解产品（未经超滤）的MALDI- TOF谱图见图1。
50010001500200025003000
mfz
图1半乳甘露低聚糖的时间飞行质进图 Flg.1 The MALDI-TOF spectrnm of GMOS
由图1可看出，质谱峰的质核比分别是527. 5、 689. 5、851. 6、1013. 7、1175.8、1337. 8、1499.9、 1662. 0、1824. 0、1986. 1、2149. 1，一共 11 个峰。
在GMOS分子中，每个结构单元是一个单糖（甘 露糖或半乳糖)残基，其质量数是162,因此，质谱峰的 荷质比(m/z)可表示为:m/z=18 + 162X« + Na+,其 中《表示单糖数目、Na+是与低聚糖结合的钠离子。 由于设备的最小量程是500 wt/z，所以图谱中没有单 糖和双糖的分子离子峰，该图的质谱峰值从527. 5开 始。各峰之间相差162,与已知单元是一个单糖（甘露 糖或半乳糖)残基相符合。从第一个峰（527. 5)开始， 其聚合度为3(三糖），此后每个峰递增1个聚合度，直 至最后的质谱峰(2149.1)为十三糖。
2. 3. 2 13CNMR 分析
GMOS的13CNMR谱图如图2所示。
为了区别不同类型的碳，其中甘露糖基用man表 示，半乳糖基用gal表示，图2中各种碳的化学位移如
ppm信号峰外（带OH的C),还有一个69.417 ppm 的信号峰，这是C6通过糖苷键与支链上的半乳糖相连 后，其化学位移向低场移动的结果。
(3)降解产物的Q-man除了出现一个75.658 ppm信号峰外（带OH的C),还有一组79. 429 ppm、 79. 300 ppm、79. 063 ppm的信号峰，这是甘露糖基C4 通过糖苷键与甘露糖相连后，受支链上半乳糖的空间 结构影响，其化学位移向低场移动的结果。
13CNMR谱说明酶解产物是一种在主链D■甘露 糖基Cs上通过糖苷键连接1个半乳糖残基支链的半 乳甘露低聚糖，其结构与带有葡萄糖支链的葡甘露低 聚糖不同。而与Vieira等⑷的研究结果基本一致。
甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖标准品的 保留时间分别为 5. 225 min、6. 822 min、8. 102 min、 9. 678 min。在降解产物HPLC谱图中没有甘露糖的 峰，说明酶解产物几乎没有单糖。保留时间为6. 8M min的峰与甘露二糖（6. 822 min)相似，说明它是二 糖，以此类推其后4个峰分别是三糖、四糖、五糖和六 糖。因为降解产物已经用截留分子量为1〇〇〇 Da的超 滤膜分离过，七糖以上的组分已被截留，因此，只有六
糖以下的组分。
Emis等[9]和Shimahara等[1°]研究证明，片甘露聚 糖酶作用于魔芋胶或槐豆胶的作用位点是多糖链的非 还原端的第3或第4个糖分子。虽然不同来源的牙甘 露聚糖酶对底物的作用深度不同，但主要产物是甘露 低聚糖，相对来说，很少产生单糖。本研究的结果与其 相似。
3结论
用矛甘露聚糖酶酶解瓜尔胶制备了功能性低聚 糖——半乳甘露低聚糖。通过正交实验得到了在底物 浓度〇. 3%、50T：下的最佳酶解条件为：pH值7. 0、酶 解时间10 h、加酶量40 U • (g瓜尔胶厂1。在此条件 下进行酶解实验，经超滤分离，得到聚合度2〜10的产 品，产率为42.3%。通过MALDI-TOF质谱分析证 明，酶解液超滤之前的GMOS组分主要由2〜10个单 糖组成，但经过截留分子量为1000 Da的超滤膜处理 后，酶解液的组分主要由二糖、三糖、四糖、五糖、六糖 组成。通过13CNMR确定，本实验酶解产品是一种在 主链D■甘露糖基Cs上通过糖苷键连接1个半乳糖支 链的半乳甘露低聚糖，其结构与葡甘露低聚糖有所不同。